細胞機械牽張拉伸應力加載系統在心血管細胞中的應用

　更新時間：2023-03-07　點擊量：731

一、背景

機械負荷是工程心血管組織中組織特性的強大調節劑。為了最終調節生化過程，必須量化機械負荷對工程心血管結構特性的影響。，涂有聚-4-羥基丁酸酯（P4HB）的多孔聚乙醇酸（PGA）支架部分嵌入有機硅層中，以允許心血管工程結構的長期單軸循環機械應變。與未應變構建體相比，這些構建體承受了兩種不同的應變量級，并且在生化性能、力學性能和微觀結構組織方面表現出差異。結果表明，當組織暴露于長時間的機械刺激時，會誘導具有較高交聯比例的膠原蛋白的產生。然而，以大應變大小的應變對組織的機械性能產生負面影響。此外，與構建體的深層相比，動態應變誘導了表層中細胞和膠原蛋白的不同排列。所提出的模型系統可用于系統地優化工程心血管組織的培養方案。

機械調節對細胞生物合成活性的影響已經在二維和三維培養條件下進行了研究，并且這種效果取決于ECM的性質。通過使用各種培養系統（例如縱向拉伸裝置和真空驅動裝置）刺激細胞。已經進行了幾項研究，著眼于機械刺激對復雜幾何形狀的組織重塑的影響。在定義明確的簡單幾何中進行了類似的實驗。塞利克塔等培養的。成纖維細胞填充的膠原凝膠（管狀構建體）在存在下精確控制變形。只有有限數量的研究集中在明確定義的機械負荷對工程心血管組織特性的影響，其中研究了ECM的從頭形成（例如，用細胞接種的聚乙醇酸（PGA）支架）。需要對工程結構中的組織特性進行機械控制。這需要詳細研究明確定義的加載條件對ECM合成和ECM組織的影響，以優化加載方案。

二、材料和方法

細胞和組織培養

人隱靜脈細胞（HSVC，肌成纖維細胞）取自一名44歲的女性，并使用常規細胞培養方法生長。44細胞在由*Dulbecco改良鷹培養基補充有10%胎牛血，1%l-谷氨酰胺和0.1%慶大霉素。

將支架真空干燥48小時，然后暴露于紫外線下1小時，隨后置于70%乙醇中4-5小時以獲得無菌。讓支架干燥過夜，然后用磷酸鹽緩沖鹽水。在細胞接種之前，將組織培養基加入支架中16小時以促進細胞附著。使用纖維蛋白凝膠作為細胞載體，將第7代的HSVC細胞接種在這些支架上。細胞以每厘米約20萬個細胞的濃度接種隨后將組織構建體在組織培養基中培養（在37°C和5%CO2).組織培養基每3-4天更換一次，由補充有10%FBS，1%l-谷氨酰胺，0.3%慶大霉素和l-抗壞血酸2-磷酸。

應變拉伸

將工程心血管構建體培養3周，包括6天無施加負荷以使細胞在接種后適應，然后以2 Hz的頻率進行1周的動態應變。應用三種不同的應變條件：0%應變，4%動態應變和8%動態應變（n = 8）。在以4%和8%應變的單獨樣品上進行所施加應變的測量2周和3周（n = 6）。

機械測試

培養3周后犧牲構建體，并在1小時內測試其機械性能（n = 6）。從樣品中除去有機硅層，并將剩余的組織置于組織培養基中以滋潤樣品。樣品的厚度和寬度使用以下命令測定 Plμ 2300 非接觸式光學圖像輪廓儀。代表面積為 8.35 × 7.85 mm2使用5×物鏡以1×的掃描速度進行掃描。通過對代表性區域求平均值來獲得厚度和寬度。

組織形成的生化測定

三、結果

循環應變對組織性質的影響

表征不同應變大小對工程心血管組織特性、構建體的切線剛度以及 DNA、GAG、膠原蛋白和 HP 交聯量的影響（表1）被量化。相對于未應變的工程組織構建體，循環菌株不會增加工程組織構建體中每干重的DNA量。然而，與未過濾的組織結構相比，機械應變結構體中每 DNA 的膠原蛋白和每 DNA 的 GAG 顯著降低。另一方面，在兩種應變條件下，每個三螺旋的HP交聯數量顯著增加。4%應變結構的切線剛度等于未應變組織結構的剛度，而8%應變結構相對于未應變結構和4%應變結構的剛度均顯著降低（圖）。4).

3周齡工程心血管結構的切線剛度（MPa）作為不同應變大小的函數。*表示與參考條件 0% （*p < 0.05）的顯著差異，表示與 4% 加載條件（p < 0.05）的顯著差異++

四、討論

機械負荷是活組織內生化過程的重要調節器。為了調節這些生化過程，必須量化機械負荷對工程心血管結構特性的影響。在這項研究中，提出了一個實驗框架，其中使用應變系統的改編版本在一次實驗中同時對單個樣品施加各種應變量級。系統可實現高通量的樣品，并且易于長時間保持無菌狀態。多孔PGA / P4HB支架部分嵌入有機硅層中，允許這些結構的重復和單軸長期機械應變。這些構建物附著在Bioflex孔（美國Flexcell Int. Corp.）上，經受兩種不同的應變量級數周，與未應變的構建物相比，在生化性能、機械性能和微觀結構組織方面顯示出差異。結果表明，長時間的機械刺激誘導具有較高交聯分數的膠原蛋白的產生，從而改善了膠原蛋白的內在機械性能。然而，過大的應變導致應變對組織的機械性能產生不利影響。此外，與構建體的深層相比，應變誘導了表層中細胞和膠原蛋白的不同排列。

為了能夠拉伸三維工程心血管結構，模型系統得到了進一步發展。組織結構的組成部分之一是涂有P4HB的PGA，以前沒有表現出彈性材料行為。因此，部分多孔PGA支架嵌入在一層薄薄的液態硅膠中。這允許對這些工程組織進行動態拉伸。在培養2周（1周菌株）后驗證應變場，支撐有機硅層的存在導致工程結構的彈性響應，這可以通過在培養2周后保留最初施加的應變的事實來說明。然而，3周后的應變分布無法確定為結構與支撐有機硅層部分分離，這大約對應于PGA機械完整性的損失。雖然應變沒有確定，但動態成分仍然存在。這意味著受控應變最終可以在 2.5-3 周的時間內應用。對不同應變場的分析表明，平均應變構成了所施加的應變，對無組織構建的膜進行了驗證。然而，組織結構的應變分布更加不均勻。可能，不均勻的變形可以歸因于由不均勻的組織形成引起的不均勻的組織特性。設置的限制是組織形成（圖。5A-C）由于有機硅層存在下營養物質供應減少而收縮到結構表面。

在本研究中，動態應變對增殖沒有影響。動態菌株和未菌株構建體之間每干重的DNA量沒有差異。以前，在相對長期的研究中，細胞增殖不受機械負荷的影響。2，28，38 然而，Mol等人。38確實顯示出自由浮動工程心血管結構的增殖水平升高，這些結構不受機械約束。必須認識到，在這項研究中，未應變的結構并非沒有壓力。HSVC屬于肌成纖維細胞表型25，38，這些肌成纖維細胞產生連續的等長張力。24 由于工程結構被支撐硅膠層限制為收縮，因此在結構中產生了內部張力。（肌）成纖維細胞收縮產生的內部應力足以限制細胞增殖。

背景當前細胞基礎研究以二維靜態培養為主，這種平面培養與實際“動態+立體"模式差別很大，導致細胞形態學、細胞分化、細胞間相互作用與體內動態環境產生明顯差異。比如細胞骨架重組、細胞形態以及基因蛋白表達改變等。

細胞牽張系統將帶來跨領域的創新：

· 動物實驗前更可靠的評估

· 干細胞分化機制

· 機械刺激力與癌癥的相關性

· 生醫材料與細胞動態特性研究

· 體外疾病微環境的快速建立

體內活細胞存在于動態的生理環境中，受到廣泛的機械刺激。包括拉伸、壓縮、剪切應力和流體靜壓力等技術背景研究表明，細胞機械感受器檢測這些刺激的作用并將信號傳遞到內部，進而對細胞活動產生影響然而在一般的體外培養和分析條件下，細胞沒有受到來自生長環境的力學刺激。機械刺激培養系統通過機械力刺激，提供與體內細胞相似的生理環境

細胞牽張培養細胞在機械牽張應力刺激下，形態和生物學功能會產生相應變化。具體方法為將細胞懸液接種在一個具有彈性膜結構的培養皿中，在細胞貼壁生長后，通過外界施加干預，使彈性膜產生一定程度的形變，從而對依附于彈性膜上的細胞提供機械牽張刺激。